文章灵感源于 Tapas 和 TechTalks 数字活动。Fast Trak 前沿细胞治疗技术中心（CATCT）团队成员分享了来自于客户合作的见解。
慢病毒载体（LVV）是在 CAR T 细胞治疗和基因治疗应用中传递遗传物质的常用载体。我们通过改造生物工艺领域的技术来开发生产方法，然而，这些下游的工作流程不仅冗长，需要大量的体力劳动，而且传染性病毒的收率极低。在本文中，我们讨论现有工作流程的过程开发难点以及这些问题的解决方法。我们将探讨可能适用于细胞和基因治疗的新技术，以及已被证明具有生物工艺价值且可进行改造以在细胞和基因制造中发挥类似功能的旧技术。
传统工艺的放大
许多下游 LVV 工艺的经典方法使用了不可放大的超速离心。由于无法获得慢病毒载体的特定解决方案，经常使用从疫苗和蛋白质（例如单克隆抗体）的生物工艺中获得的传统纯化方法。这些经典方法既费时又费力。它们往往还包括对环境开放的多个步骤，构成了微生物污染的风险。
设计下游工艺
工艺开发人员的目标必须是以满足可扩展、一次性使用和封闭式下游 LVV 工艺的当前行业标准为目标，以实现超过 30％ 的病毒载体回收率，这是当前的行业标准。在本案例研究中，我们试图平衡需求，以达到 1×108 感染滴度/mL 的浓度，去除 2-3 log 污染物（例如宿主细胞蛋白和宿主细胞 DNA）的目标。理想情况下，我们将设计一个流程，使得整个下游工作流程可以在一天之内完成（即，在室温下将处理时间限制为少于八小时）。
解决行业难题的现代方法
图 1 突出显示了现代工艺流程中的步骤和关键难点。
图 1. 下游 LVV 工艺的现代制造工艺步骤，包括关键难点。
在现代工艺中，慢病毒载体是从上游收集的；在这种情况下，我们在无血清培养基中使用悬浮培养。然后，使用 Benzonase™来消化核酸。这种酶非常昂贵，并且使得孵化时间增加到漫长的一天。接下来是澄清，包括通过正向流过滤（NFF）去除细胞碎片。
技巧：在此，必须要确保消耗品与产品兼容并具有可扩展性。一些报告说很难从该步骤中获得高病毒回收率。
接下来是超滤/洗滤 (UF/DF)，旨在浓缩病毒并使用切向过滤 (TFF) 交换缓冲液。到目前为止，TFF 是整个下游工艺工作流程中最漫长的一步。一升的量至少需要三个小时。
接下来是层析纯化。与腺相关病毒（AAV）不同，没有针对 LVV 的特异性亲和纯化方法。业界一直在使用阴离子交换的层析方法（AEX），但这并不能很好地应用于LVV。阴离子交换层析通常需要高盐浓度才能洗脱病毒，而这种病毒并不能很好地耐受。
之后是一个可选的浓缩步骤，供需要更高浓度病毒的群体使用。但是必须注意的是，下游工艺中每增加一个步骤都会降低病毒的回收率。工作流程的最后是无菌过滤。
除了下游工艺中的难点之外，病毒本身也面临挑战。慢病毒作为包膜病毒从宿主细胞中萌芽，为此必须将该病毒与宿主细胞进行物理隔离。LVV 要求极窄的 pH 值、温度、剪切应力、盐浓度和渗透压范围。另外，该病毒在室温下易于降解。最重要的是，下游工艺平台中的许多消耗品并非专用于 LVV。
优化下游工艺
在描述我们如何优化工艺之前，必须要强调分析在评估结果中的关键作用。尽早锁定分析至关重要，我们从而可以在工艺开发工作的所有阶段使用相同的度量方法。而且，我们发现许多自动化分析都有其优点，包括使用液体处理器稀释所有样品，以及将平板清洗机用于所有酶联免疫吸附测定（ELISA）。另外，使用机器人对结果的可重复性至关重要。它最大程度地减少了人为错误，并为我们的员工腾出时间，以进行数据分析等其他工作。
技巧：对于测量病毒滴度的基因转染测定，请查看细胞接种和流式细胞仪过程中操作员之间的差异。这也为其余的测定增加了可变性。
优化工艺的示例 – 1 L LVV 下游工作流程
表 1 总结了我们的优化工作。
| 描述 | 核酸酶 | 正向流过滤（NFF） | 切向流过滤（TFF）UF/DF | 层析 | TFF UF | NFF |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 研究变量 | 浓度、孵育时间、温度 | 孔径、材料、过滤面积、LMH、过滤器数量 | 孔径、过滤面积、剪切率 | 树脂、流速、负载/洗脱缓冲液 | 孔径、过滤面积、剪切率 | 过滤器配置、装液、LMH |
| 步骤达到的回收率 | 106.3% ± 11.9% (n=19) | 48.6％±10.2％（最近 30 个实验） | 58.3％±10.5％（无已知问题的最近 10 个实验） | 80%–95% | 70.1％±17.9％（使用当前参数的最近 7 个实验） | |
| 宿主细胞蛋白清除率 | 80%–95% | 80%–95% | ||||
| 宿主细胞 DNA 清除率 | 70%–90% | 80%–95% | ||||
简言之，在室温下用 Benzonase 孵育 15 分钟足以降解低于 200 bp 的大多数 DNA，以满足无开放读码框架（ORF）的法规要求。我们确定了可扩展和兼容的耗材，用于澄清步骤并微调了此步骤，以最大程度地恢复病毒。对于第一步 UF/DF，我们从宿主细胞中获得了不错的蛋白质和 DNA 回收率和清除率。此外，我们还确定了用于工艺开发的高通量技术和适当缩小模型。对于层析纯化，我们开发了一种多峰色谱（MMC）步骤，该步骤结合了尺寸排阻和阴离子交换的特性。重要的是，MMC 步骤很简单，处理过程也很温和。对于最后的无菌过滤步骤，我们通过优化过滤材料、层数和其他因素来最大程度地提高回收率。
表 1. 1 L LVV DSP 工作流程的工艺开发和结果摘要
LMH = L/m2/h
下游病毒载体工艺开发的总体最佳实践
技巧：上游产生的病毒将如何影响下游工艺。
例如，我们的悬浮培养工艺产生的细胞密度比我们的贴壁培养工艺要高得多，这给过滤步骤带来了挑战。另外，这些更高的细胞密度导致了更高的宿主细胞蛋白质和必须去除的 DNA 污染物。还需考虑的是，每个操作单元将如何影响下一个操作单元。因此，我们建议先优化一个操作单元，然后继续按顺序优化工作流程中的下一个单元。
技巧：从一开始就考虑扩展性和封闭的工艺，因为理想情况下，您的工艺流程将被转移到药品生产质量管理规范（GMP）环境中。因此，您需要确保已对所有设备进行消毒，并且流程为封闭式。另外，谨记在早期就考虑到稳定性，例如室温保持。
观看活动视频，获取有关 LVV 下游案例研究、分析等的详细信息。
关于 Fast Trak 前沿细胞治疗技术中心（CATCT）
这项工作是在加拿大多伦多的 Fast Trak 前沿细胞治疗技术 (CATCT)中心进行的。该中心由 Cytiva，CCRM 和加拿大政府于 2016 年 1 月合作设立。该中心旨在开发有效生产细胞和基因治疗产品的下一代解决方案，以使患者更容易获得这些治疗方法。截止 2020 年，该中心已经颇具规模，拥有 100 多名熟悉工艺开发和优化、制造以及许多其他专业领域的成员。了解关于 Fast Trak 细胞和基因治疗服务的更多信息。